Οι νέες τεχνολογίες γονιδιωματικής στη μάχη κατά των κουνουπιών και των ιών που μεταφέρουν

Η γονιδιωματική αποτελεί ένα διεπιστημονικό πεδίο της βιολογίας που συνδυάζει τις πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις της τεχνολογίας των νανοϋλικών και των υπολογιστικών συστημάτων. Η ανάπτυξή της, ξεκινώντας από το Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος (1990-2003), έφερε επανάσταση στην κατανόηση της σύστασης του γενετικού υλικού μιας πληθώρας οργανισμών, από τον άνθρωπο μέχρι τα βακτήρια.

Η έννοια της γονιδιωματικής όταν μεταφέρθηκε στο επίπεδο της ταυτόχρονης, μαζικής μελέτης του γενετικού υλικού ενός συνόλου οργανισμών ονομάστηκε μεταγονιδιωματική, ήδη από το 1998. Παρότι τότε οι δυνατότητες της τεχνολογίας δεν επέτρεπαν την εφαρμογή της μεταγονιδιωματικής, η μείωση του κόστους ανάλυσης του γενετικού υλικού οδήγησε στην ευρεία χρήση της.

Η μεταγονιδιωματική βρήκε χώρο σε πλήθος εφαρμογές που αφορούν στην υγεία και τη διατροφή, από την ανάλυση της σύστασης μιας μικροβιακής κοινότητας στο περιβάλλον, στο ανθρώπινο σώμα ή ακόμα και σε μία επιφάνεια, μέχρι την ανάλυση της προέλευσης των συστατικών προϊόντων κρέατος.

Η δυνατότητα προσαρμογής της τεχνολογίας της μεταγονιδιωματικής για την ανάλυση κάθε είδους μείγματος οργανισμών ήταν η απαρχή ενός ερευνητικού προγράμματος που χρηματοδοτήθηκε από την Ειδική Υπηρεσία Διαχείρισης και Εφαρμογής Δράσεων στους τομείς Έρευνας, Τεχνολογικής Ανάπτυξης και Καινοτομίας (ΕΥΔΕ-ΕΤΑΚ) του Υπουργείου Ανάπτυξης και Επενδύσεων.

Η μελέτη εντάχθηκε στο πλαίσιο της πρώτης δράσης ΕΡΕΥΝΩ – ΔΗΜΙΟΥΡΓΩ – ΚΑΙΝΟΤΟΜΩ του ΕΣΠΑ 2014-2020 και αποτέλεσε την πρώτη εφαρμογή της τεχνολογίας της μεταγονιδιωματικής στην ανάλυση των κουνουπιών και άλλων αιματοφάγων εντόμων.

Η ανάλυση της σύστασης και εποχικής διακύμανσης του πληθυσμού των κουνουπιών μιας περιοχής αποτελεί έναν από τους βασικότερους παράγοντες στην επιδημιολογία νοσημάτων που μεταφέρονται από  τα κουνούπια.

Ο προσδιορισμός των ειδών των κουνουπιών που κυκλοφορούν σε μια περιοχή έχει άμεση σχέση τόσο με την αποτελεσματικότητα και την οικονομία των ψεκασμών, όσο και με την εκτίμηση του κινδύνου εμφάνισης νοσημάτων, όπως ο πυρετός του Δυτικού Νείλου, η ελονοσία, κ.λ.π. Τέτοια είναι η σημασία του προσδιορισμού της σύστασης του πληθυσμού των κουνουπιών που στη χώρα μας, αλλά και παγκοσμίως, λειτουργούν προγράμματα επιτήρησής τους αξίας πολλών εκατομμυρίων ευρώ.

Μέχρι σήμερα, η ανάλυση των κουνουπιών που συλλέγονται σε παγίδες γίνεται με τη μορφολογική ταυτοποίηση των ειδών ένα προς ένα κάτω από το μικροσκόπιο. Η διαδικασία αυτή εκτός από χρονοβόρα, εξαρτάται άμεσα από την εμπειρία του παρατηρητή. Η διαδικασία της ταυτοποίησης περιπλέκεται ακόμα περισσότερο καθώς σε αρκετά είδη κουνουπιών υπάρχει αδυναμία διαχωρισμού, καθώς έχουν την ίδια μορφολογία. Δεν αποτέλεσε έκπληξη η μειωμένη δυνατότητα προσδιορισμού πολλών ειδών κουνουπιών από Ευρωπαϊκά εργαστήρια που συμμετείχαν σε πρόσφατο εθελοντικό ποιοτικό έλεγχο των υπηρεσιών τους.

Από την άλλη μεριά, η διαφοροποίηση των ειδών με βάση το γενετικό υλικό τους (barcoding) αποτελεί εδώ και χρόνια το χρυσό κανόνα για την ακρίβεια στην ταυτοποίηση. Μια τέτοια ανάλυση (βασιζόμενη στη μέθοδο PCR) που γίνεται για κάθε ένα κουνούπι της παγίδας ξεχωριστά, είναι απαγορευτική τεχνικά αλλά και οικονομικά εμποδίζοντας την ευρεία χρήση της.

Η μεθοδολογία, που πρότεινε ομάδα επιστημόνων από τα Τμήματα Ιατρικής και Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης (ΔΠΘ) με εταίρους τις εταιρείες Εβροφάρμα και Γεωτεχνοϋγειονομική Βορείου Ελλάδος, ενσωμάτωσε την τεχνολογία της μεταγονιδιωματικής στην ταυτοποίηση των κουνουπιών.

Η παράλληλη ανάλυση του γενετικού υλικού όλων των κουνουπιών (metabarcoding)  σε μια παγίδα με το πάτημα ενός κουμπιού έφερε την ακρίβεια της ταυτοποίησης ενός είδους στο επίπεδο του πληθυσμού. Με πολύ υψηλή ακρίβεια (95.94%), η νέα μεθοδολογία ξεπερνά σε ακρίβεια αλλά και ταχύτητα οποιαδήποτε μεθοδολογία παρατήρησης, ενώ έχει τη δυνατότητα αναγνώρισης ακόμη και νέων ειδών κουνουπιών (από τα 3500 που υπάρχουν στο κόσμο) που ο παρατηρητής δεν έχει συναντήσει ποτέ. Ιδιαίτερα η τελευταία ιδιότητα θα βοηθήσει στον εντοπισμό χωροκατακτητικών ειδών που προωθούνται σε νέες περιοχές, κυρίως λόγω της κλιματικής αλλαγής, μεταφέροντας εξωτικούς λοιμογόνους παράγοντες όπως οι ιοί.

Μια τεχνολογία που έχει την ικανότητα να μελετά ταυτόχρονα το γενετικό υλικό μεγάλου αριθμού ατόμων έχει φυσικά χρησιμοποιηθεί και στην ανάλυση της παρουσίας όλων των ιών (ίωμα) σε δείγματα ανθρώπινης ή περιβαλλοντικής προέλευσης, κατ’ αντιστοιχία με τη μελέτη του εντερικού μικροβιώματος. Χιλιάδες νέοι ιοί, άγνωστοι μέχρι σήμερα, έχουν αναγνωριστεί παγκοσμίως και αποτελούν βάση αναφοράς σε περίπτωση νέων επιδημιών.

Η ανάλυση ιών κορώνα σε νυχτερίδες τα χρόνια που προηγήθηκαν της πανδημίας COVID-19 αποτέλεσε κρίσιμο εργαλείο στην αναγνώριση του ιού SARS-CoV-2 αλλά και της φυσικής πηγής του. Παρότι η ανάλυση αυτή διεξάγεται παγκοσμίως δεν έχει μέχρι σήμερα εφαρμοστεί στην Ελλάδα.

Με υλικό από παγίδες που τοποθετήθηκαν στην Περιφέρεια Ανατολικής Μακεδονίας και Θράκης (ΠΑΜΘ), εντοπίστηκαν 34 ιοί σε 24 διαφορετικά είδη κουνουπιών. Πολλοί από τους ιούς που εντοπίστηκαν αποτελούν στελέχη ήδη γνωστών ιών που έχουν αναγνωριστεί από την Κίνα μέχρι τη Νότια Αμερική.

Ωστόσο, 15 ιοί απέχουν τόσο πολύ από οποιονδήποτε άλλο ιό που έχει εντοπιστεί παγκοσμίως και αναγνωρίστηκαν ως νέα είδη. Οι νέοι αυτοί ιοί, παρόλο που δεν γνωρίζουμε ακόμη ποιους οργανισμούς μολύνουν, ή αν έχουν τη δυνατότητα να μεταφερθούν στον άνθρωπο, χρήζουν άμεσης μελέτης καθώς φαίνεται να βρίσκονται σε αρκετά κουνούπια της περιοχής της ΠΑΜΘ.

Η ανάλυση των ιών επεκτάθηκε και σε άλλα αιματοφάγα έντομα, φορείς ασθενειών, όπως οι σκνίπες Culicoides. Οι σκνίπες αυτές, παρότι είναι κατά πολύ μικρότερες από τα κουνούπια, αποτελούν όχληση σε ζώα και ανθρώπους, κυρίως γύρω από κτηνοτροφικές μονάδες, ενώ μεταφέρουν σημαντικές ασθένειες, όπως ο καταρροϊκός πυρετός των προβάτων. Η μελέτη σε 10 είδη Culicoides της Θράκης οδήγησε στην αναγνώριση 14 νέων ιών, με τη μελέτη να αποτελεί την πρώτη του είδους στην περιοχή της Νοτιοανατολικής Ευρώπης.

Η δυνατότητα που δίνουν οι νέες τεχνολογίες για τη γρήγορη και με ακρίβεια παράλληλη ανάλυση των κουνουπιών και των ιών που δυνητικά μεταφέρουν προσφέρει μια νέα δυναμική στην εκτίμηση των μέτρων που πρέπει να εφαρμοστούν κάθε χρόνο σε μια περιοχή για την πρόληψη της εμφάνισης μεταδοτικών ασθενειών.

Η στοχευμένη χρήση μέτρων πρόληψης με τη χρήση της μεθοδολογίας που αναπτύχθηκε στο ΔΠΘ θα μπορέσει άμεσα να φέρει αποτελέσματα στην Ελλάδα αλλά και παγκοσμίως στην αντιμετώπιση των νοσημάτων που μεταδίδονται από έντομα.

Η μεθοδολογία αυτή σε συνδυασμό με τεχνολογίες ανάλυσης μετεωρολογικών δεδομένων και μαθηματικών μοντέλων αναμένεται να αποτελέσει μια συνολική νέα πρόταση από το ΔΠΘ στην αντιμετώπιση των ασθενειών μεταδιδόμενων από έντομα.

Η συνολική αυτή πρόταση ανακοινώθηκε (θα ανακοινωθεί) σε ειδικό συμπόσιο με τη συμμετοχή ειδικών επιστημόνων από την Ελλάδα και το εξωτερικό. Σημαντική θα είναι (ήταν) η παρουσία ομάδας καθηγητών και ερευνητών από το Lousisina State University με σκοπό την επέκταση της συνεργασίας πάνω στη μεθοδολογία που αναπτύξαμε.

* Ιωάννης Καρακασιλιώτης, Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρικής Βιολογίας – Μοριακής Ιολογίας, Τμήμα Ιατρικής ΔΠΘ

Kassela K, Kouvela A, de Courcy Williams M, Konstantinos Konstantinidis, Rosa Freitas MG, Andreas Nearchou, Elisavet Gatzidou, Stavroula Veletza, Georgios C. Boulougouris, Nikolaos Dovrolis, Ioannis Karakasiliotis. From qualitative to quantitative insect metabarcoding: an in tandem multilocus mosquito identification methodology, bioRxiv, 2020,  doi: 10.1101/2020.11.22.393140

Dovrolis N, Kassela K, Konstantinidis K, Kouvela A, Veletza S, Karakasiliotis I. ZWA: Viral genome assembly and characterization hindrances from virus-host chimeric reads; a refining approach. PLoS Comput Biol. 2021 Aug 9;17(8):e1009304. doi: 10.1371/journal.pcbi.1009304.

Konstantinidis K, Bampali M, de Courcy Williams M, Dovrolis N, Gatzidou E, Papazilakis P, Nearchou A, Veletza S, Karakasiliotis I. Dissecting the Species-Specific Virome in Culicoides of Thrace. Front Microbiol. 2022 Mar 7;13:802577. doi: 10.3389/fmicb.2022.802577

Konstantinidis K, Dovrolis N, Kouvela A, Kassela K,  Rosa Freitas MG, Nearchou A, de Courcy Williams M, Veletza S, Karakasiliotis I. Defining Virus-Carrier Networks that Shape the Composition of the Mosquito Core Virome of a Local Ecosystem. Virus Evolution doi: 10.1093/ve/veac036

Kofidou M, de Courcy Williams M, Nearchou A, Veletza S, Gemitzi A, Karakasiliotis I. Applying Remotely Sensed Environmental Information to Model Mosquito Populations. Sustainability 2021, 13(14), doi: 10.3390/su13147655