SweetBiOmics: Εκχυλίσματα κερασιού για πολλαπλασιασμό κυττάρων εντόπισαν ερευνητές του ΑΠΘ

Συνδυασμένη Προσέγγιση – Ομικών Τεχνολογιών και Βιοπληροφορικής για τη Δημιουργία του Άτλαντα των Ελληνικών Γενετικών Πόρων Κερασιάς

Το SweetBiOmics στοχεύει:

• Στη δημιουργία γονιδιωματικών, επιγενετικών, μεταγραφομικών, πρωτεομικών, μεταβολομικών και φαινοτυπικών δεδομένων με τη χρήση προηγμένων στατιστικών και βιοπληροφορικών προσεγγίσεων με κεντρικό σκοπό την ανάλυση του συνόλου του γενετικού υλικού του ελληνικού καλλιεργούμενου κερασιού.

• Στην εφαρμογή μιας ολοκληρωμένης συγκριτικής ανάλυσης των φυσιολογικών χαρακτηριστικών του καρπού (ποιότητα) σε συνδυασμό με την ανάλυση του φαινοτύπου, του μεταγραφήματος και του μεταβολόμικου προφίλ ώστε να δημιουργηθούν συστήματα ευρύτερης αξιοποίησης των γενετικών πόρων της κερασιάς στην Ελλάδα.

• Στην ανάπτυξη μιας βάσης δεδομένων αναφοράς για την καλλιεργούμενη κερασιά (Proteogenomic Άτλας) ώστε να προσδιοριστεί το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης και των πρωτεϊνών σε μια ποικιλία ιστών.

Περιγραφή Ερευνητικών Αποτελεσμάτων:

Αξιολόγηση φαινοτυπικών χαρακτηριστικών νέων υβριδίων κερασιών (Prunus avium L.).

Η παρούσα μελέτη εστιάζει στην ανάπτυξη νέων υβριδίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά όπως η παραγωγικότητα, το μέγεθος των καρπών, τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και η αυτοσυμβατότητα. Για το σκοπό αυτό διασταυρώθηκαν τριάντα διαφορετικές ποικιλίες και παρήγαγαν υβρίδια που αξιολογήθηκαν. Η βέλτιστη υβριδική ομαδοποίηση επιτεύχθηκε όταν στην ανάλυση συμπεριλήφθηκαν χαρακτηριστικά μεγάλης οικονομικής σημασίας όπως το σχήμα και το μέγεθος των καρπών, η ανάπτυξη και οι ημέρες μέχρι την ανθοφορία. Με βάση τα αποτελέσματα αναπτύχθηκαν νέα υβρίδια κερασιάς με τον ιδιαίτερο χαρακτήρα της αυτοσυμβατότητας. Τα ευρήματά αυτά παρέχουν σημαντικές πληροφορίες που θα αξιοποιηθούν σε μελλοντικά προγράμματα βελτίωσης.

Αποτύπωση των χαρακτηριστικών ποιότητας και του μεταβολικού προφίλ κερασιών στην Ελλάδα.

Το παρακάτω άρθρο περιλαμβάνει τον χαρακτηρισμό των φυσικοχημικών, αισθητηριακών και βιοενεργών χαρακτηριστικών είκοσι δύο ποικιλιών κερασιών. Όλοι οι γενότυποι ήταν πλούσιοι σε πολυφαινόλες, κυρίως σε κερκετίνη-3,4-Ο- διγλυκοσίδη, εσκουλετίνη, ρουτίνη και νεοχλωρογενικό οξύ. Επίσης, οι γενότυποι διακρίθηκαν με βάση την περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνες και την περιεκτικότητα σε γλυκοζίδια κυανιδίνης-3-Ο-ρουτινοσίδης και πεονιδίνης. Συνολικά, οι ποικιλίες «Τσολακέικα» και «Μπακιρτζέικα» παρουσίασαν την υψηλότερη αποδοχή από τον καταναλωτή, ενώ οι ποικιλίες «Βασιλειάδη» και «Τραγάνα Έδεσης-Ναούσης» και η σειρά αναπαραγωγής «TxAg33» περιείχαν υψηλά επίπεδα πολυφαινολικών ουσιών.

Επαναπροσδιορισμός της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος της κερασιάς (Prunus avium L.).

Ο καρπός της κερασιάς είναι πολύ σημαντικός για την ανθρώπινη υγεία λόγω των θρεπτικών και ευεργετικών για ιδιοτήτων του. Οι ποικιλίες κερασιάς παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα φαινοτυπικής ποικιλότητας σε σημαντικά αγρονομικά χαρακτηριστικά, όπως ο χρόνος ανθοφορίας και οι αντιδράσεις έναντι των παθογόνων. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος (WGRS) για τον χαρακτηρισμό της γενετικής ποικιλότητας, της δομής του πληθυσμού και των παραλλαγών σε μια ομάδα 20 γενότυπων κερασιάς και ενός γενοτύπου άγριας κερασιάς. Οι 21 γενότυποι αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας ως βάση τη γονιδιωματική αλληλουχία αναφοράς της ποικιλίας «Satonishiki». Η διακριτική ανάλυση DAPC με τη χρήση των δεικτών SNPs αποκάλυψε δύο ομάδες γενότυπων.

Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν τα θεμέλια για περαιτέρω μεγάλης κλίμακας χαρακτηρισμό των γενοτύπων της κερασιάς επιτρέποντας στους παραγωγούς να ενσωματώσουν στις ποικιλίες διάφορες παραλλαγές γενοτύπων και αλληλόμορφων ώστε να ρυθμίσουν με ακρίβεια τον χρόνο ανθοφορίας και ωρίμανσης καθώς και την αντοχή σε ασθένειες.

Φαινοτυπική, γενετική και επιγενετική ανάλυση μεταξύ διαφορετικών γονιδιακών δεξαμενών στην κερασιά.

Το γονιδίωμα της κερασιάς περιέχει μεγάλη ποικιλία φαινοτύπων όσο αφορά το μέγεθος και το σχήμα των καρπών, καθώς και την περιεκτικότητα σε σάκχαρα κ.λ.π. Η υψηλή φαινοτυπική διακύμανση μπορεί να είναι αποτέλεσμα γενετικής ή επιγενετικής ποικιλότητας. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι εκτός από την αλληλουχική παραλλαγή, η επιαλληλουχική παραλλαγή μπορεί να δημιουργήσει νέους κληρονομήσιμους φαινοτύπους. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε γενετική και επιγενετική αξιολόγηση (χρησιμοποιώντας τους δείκτες AFLP και MSAP αντίστοιχα), συνοδευόμενες από ανάλυση συσχέτισης φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με τα γονίδια της κερασιάς. Η μέση γενετική ποικιλότητα ήταν μεγαλύτερη από την επιγενετική ποικιλότητα ενώ δεν βρέθηκε σημαντική σχέση μεταξύ γενετικής και επιγενετικής. Επιπλέον, σύμφωνα με τις αναλύσεις συσχέτισης, βρέθηκε ότι η επιγενετική ποικιλότητα σε προκαθορισμένους πληθυσμούς κερασιών είχε ισχυρότερο αντίκτυπο στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με την γενετική ποικιλότητα.

Δημιουργία του άτλαντα πρωτεϊνών και γονιδίων διαφορετικών ιστών της κερασιάς.

Η ανάλυση σε επίπεδο γονιδιώματος παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη βιολογία των φυτών. Η κατανόησή της στοιχειομετρίας του συμπλέγματος γονιδίου-πρωτεΐνης είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη στα φυτά. Η πολυπλοκότητα του πρωτεώματος έχει ωθήσει την ερευνητική κοινότητα σε μια πρωτεογονιδιωματική προσέγγιση των αναλύσεων. Στην παρούσα μελέτη δημιουργήθηκε ένας ποσοτικός άτλαντας πρωτεινών και γονιδίων 15 κύριων ιστών της ποικιλίας κερασιάς «Τραγανά Εδέσσης» που αποτελείται από 29.247 γονίδια και 7584 πρωτεΐνες. Η πρωτεογονιδιωματική ανάλυση αποκάλυψε διαφορές μεταξύ των γονιδίων και πρωτεΐνών, σε γονίδια που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες καθώς και αλλεργιογόνα, εντός και μεταξύ των διαφορετικών ιστών. Επιπλέον, εντοπίστηκαν πιθανοί ρυθμιστές της ανάπτυξης των καρπών, ιδίως γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των ανθοκυανινών και των φλαβονοειδών. Επίσης, παρατηρήθηκε συμμετοχή της σηματοδότησης του αιθυλενίου και της αποικοδόμησης της πηκτίνης στην ωρίμανση των καρπών του κερασιού. Ομάδες γονιδίων και πρωτεϊνών με παρόμοιες και διαφορετικές τάσεις έκφρασης και καταστολής σε διάφορους ιστούς και αναπτυξιακά στάδια αποκάλυψαν μια σχετικά χαμηλή συσχέτιση αφθονίας γονιδίων/πρωτεΐνών. Η παρούσα πρωτεογονιδιωματική ανάλυση επέτρεψε την αναγνώριση 17 νέων πρωτεϊνών κερασιάς που δεν έχουν κατατεθεί στις τρέχουσες διαθέσιμες βάσεις δεδομένων. Με στόχο τη διάχυση του άτλαντα στην επιστημονική κοινότητα αναπτύχθηκε η βάση δεδομένων Sweet Cherry Atlas (https://grcherrydb.com/). Η παρούσα εργασία αποτελεί μια πλούσια πηγή γνώσης για μελλοντική διερεύνηση των γονιδίων και πρωτεϊνών του είδους Prunus.

Βιοστατιστική ανάλυση πρωτεϊνών και γονιδίων ποικίλων ιστών κερασιάς.

Η ανάλυση των μεταγραφών σε επίπεδο γονιδιώματος είναι μια μέθοδος που παράγει σημαντικά δεδομένα για τη βιολογία των φυτών σε συστημικό επίπεδο. Η έλλειψη κατανόησης των σχέσεων μεταξύ πρωτεϊνών και γονιδίων στα φυτά απαιτεί περαιτέρω ενδελεχή ανάλυση σε πρωτεογονιδιωματικό επίπεδο. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να πραγματοποιηθεί μια στοχευμένη ανάλυση σε επίπεδο γονιδίου/πρωτεΐνης ώστε να αξιολογηθεί η δομή της σχέσης τους και οι πιθανές βιολογικές επιπτώσεις. Για τη ομαδοποίηση των ζευγών γονιδίου/πρωτεΐνης και την αποκάλυψη των σχέσεων αιτίου-αποτελέσματός τους, με στόχο την αξιολόγηση των σχετικών βιολογικών λειτουργιών χρησιμοποιήθηκαν η σταθμισμένη ανάλυση δικτύου συσχέτισης (correlation networks) και η αιτιακή μοντελοποίηση (causal models). Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη φορά που χρησιμοποιείται αιτιώδης μοντελοποίηση σε πρωτεογονιδιωματικά δεδομένα στα φυτά. Η ανάλυση αποκάλυψε τη σύνθετη φύση των αιτιακών σχέσεων μεταξύ γονιδίων/πρωτεϊνών που σχετίζονται με χαρακτηριστικά ενδιαφέροντος στα πολυετή οπωροφόρα δέντρα. Η αιτιολογική ανάλυση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την καλύτερη κατανόηση των σχέσεων γονιδίου/πρωτεΐνης, διεγείροντας τη βιολογική ερμηνεία και διευκολύνοντας την περαιτέρω μελέτη του πρωτεογονιδιωματικού άτλαντα στα φυτά.

Οι επιδράσεις των εκχυλισμάτων κερασιάς έναντι του οξειδωτικού στρες στους ανθρώπινους ινοβλαστούς.

Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί ένα έντονο ενδιαφέρον για καινοτόμα και πολυλειτουργικά συστατικά στην έρευνα. Οι φυσικές πηγές κατέχουν σημαντικό ρόλο λόγω των πολλαπλών ωφελημάτων τους. Η παρούσα μελέτη στοχεύει στην παρουσίαση των πλειοτροπικών δράσεων των εκχυλισμάτων κερασιάς, στους ανθρώπινους πρωτογενείς ινοβλαστούς. Η ανάλυση επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση ασφάλειας και αποτελεσματικότητας που βασίζεται στην ανάλυση κυτταροτοξικότητας και γονιδιακής έκφρασης υπό οξειδωτικό στρες. Συγκεκριμένα, το εκχύλισμα κερασιάς αποδείχθηκε μη κυτταροτοξικό στους ανθρώπινους ινοβλαστούς. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι το εκχύλισμα κερασιάς έχει in vitro προστατευτικές ιδιότητες στους ανθρώπινους δερματικούς ινοβλαστούς υπό οξειδωτικό στρες που σχετίζονται με την αντιοξειδωτική δράση, την αντιφλεγμονώδη απόκριση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καθώς και τη γήρανση των κυττάρων. Για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι το εκχύλισμα κερασιάς αποτελεί ένα πολυλειτουργικό συστατικό καθώς μεσολαβεί σε αρκετές in vitro διαδικασίες, υπογραμμίζοντας τη δυνατότητά του να χρησιμοποιηθεί ως ενεργό συστατικό σε προϊόντα περιποίησης δέρματος.

Ανίχνευση των επιπτώσεων του εκχυλίσματος κερασιάς στο ανθρώπινο δέρμα.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθούν οι επιδράσεις του εκχυλίσματος κερασιάς της ποικιλίας «Βασιλειάδη» σε ανθρώπινα μοντέλα in vitro προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή επίδρασή του στο δέρμα. Η παρούσα μελέτη εστίασε στη δισδιάστατη καλλιέργεια πρωτογενών φυσιολογικών ανθρώπινων επιδερμικών κερατινοκυττάρων (NHEK) που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχύλισμα κερασιάς. Αρχικά, μελετήθηκε η πιθανή κυτταροτοξικότητα του εκχυλίσματος προσδιορίζοντας τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ATP. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η πιθανή ευερεθιστότητά του στο δέρμα χρησιμοποιώντας τρισδιάστατο μοντέλο δέρματος. Για να κατανοηθεί καλύτερα η βιοδραστικότητα του καρπού, χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση qPCR ώστε να μελετηθεί η έκφραση διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται στις λειτουργίες του δέρματος. Τα πειράματά που πραγματοποιήθηκαν έδειξαν ότι το εκχύλισμα κερασιάς είναι μη τοξικό σε καλλιέργεια δισδιάστατων κερατινοκυττάρων καθώς και μη ερεθιστικό σε τρισδιάστατο μοντέλο δέρματος. Τέλος παρατηρήθηκε ότι το εκχύλισμα ενεργοποίησε σημαντικά μονοπάτια για τη βέλτιστη λειτουργία της επιδερμίδας, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η ανοσολογική και η φλεγμονώδης απόκριση.

Παραδείγματα Εφαρμογής των Ερευνητικών Αποτελεσμάτων:

Ο επιστημονικός αντίκτυπος, στο πεδίο της επιστήμης των φυτών, αφορά:

α) την ευρεία ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας της κερασιάς στην Ελλάδα σε επίπεδο ολόκληρου γονιδιώματος (whole genome re-sequencing analysis)

β)τον προσδιορισμό των μοριακών δεικτών που σχετίζονται με την ποιότητα του καρπού και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά, χρήσιμα για την επιλογή των βελτιωμένων γενοτύπων,

γ) την συγκριτική ανάλυση των φυσιολογικών δεδομένων σε συνδυασμό με τη φαινοτυπική, μεταγραφομική, πρωτεομική και μεταβολομική ανάλυση των γενετικών πόρων της κερασιάς στην Ελλάδα,

δ) την ανάπτυξη μιας βάσης δεδομένων αναφοράς για την καλλιεργούμενη κερασιά (RNA-seq Άτλας) ώστε να προσδιοριστεί το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε διάφορους ιστούς με τη χρήση της τεχνολογίας NGS και ε) την ανάπτυξη πολλαπλών -ομικών εργαλείων.

Η πιο σημαντική επιστημονική συμβολή του έργου SweetBiOmics είναι ότι ο φαινοτυπικός, βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός των ελληνικών ποικιλιών κερασιού θα επιτρέψει τη χρήση τους σε μελλοντικά προγράμματα βελτίωσης.

Σχετικές Δημοσιεύσεις & Ανακοινώσεις:

Ganopoulos I, Farsakoglou AM, Aravanopoulos F, Molassiotis A, Michailidis M, Malliarou E, et al. Towards sweet cherry (Prunus avium L.) breeding: phenotyping evaluation of newly developed hybrids. Euphytica. 2018;214.

2) Karagiannis E, Sarrou E, Michailidis M, Tanou G, Ganopoulos I, Bazakos C, et al. Fruit quality trait discovery and metabolic profiling in sweet cherry genebank collection in Greece. Food Chem. 2021;342 October 2020:128315. doi:10.1016/j.foodchem.2020.128315.

3) Xanthopoulou A, Manioudaki M, Bazakos C, Kissoudis C, Farsakoglou AM, Karagiannis E, et al. Whole genome re-sequencing of sweet cherry (Prunus avium L.) yields insights into genomic diversity of a fruit species. Hortic Res. 2020;7.

4) Avramidou E V., Moysiadis T, Ganopoulos I, Michailidis M, Kissoudis C, Valasiadis D, et al. Phenotypic, genetic, and epigenetic variation among diverse sweet cherry gene pools. Agronomy. 2021;11:1–15.

5) Letsiou S, Karamaouna A, Ganopoulos I, Kapazoglou A, Xanthopoulou A, Sarrou E, et al. The pleiotropic effects of Prunus avium L. extract against oxidative stress on human fibroblasts. An in vitro approach. Mol Biol Rep. 2021;48:4441–8. doi:10.1007/s11033-021- 06464-0.

6) Letsiou S, Ganopoulos I, Kapazoglou A, Xanthopoulou A, Sarrou E, Tanou G, et al. Probing the effects of sweet cherry (Prunus avium L.) extract on 2D and 3D human skin models. Mol Biol Rep. 2022;:1–7. doi:10.1007/s11033-021-07076-4.

7) Xanthopoulou A, Moysiadis T, Bazakos C, Karagiannis E, Madesis P, Ganopoulos I, et al. The perennial fruit tree proteogenomics atlas : a spatial map of the sweet. Plant J. 2021.

8) Ganopoulou M, Michailidis M, Angelis L, Ganopoulos I, Molassiotis A, Xanthopoulou A, et al. Could Causal Discovery in Proteogenomics Assist in Understanding Gene – Protein Relations ? A Perennial Fruit Tree Case Study Using Sweet Cherry as a Model. Cells. 2022;11.

9) Zambounis, A., Ganopoulos, I., Aravanopoulos, F., Hilioti, Z., Madesis, P., Molassiotis, A., Tsaftaris, A. and Xanthopoulou, A., 2020. Genomics Opportunities and Breeding Strategies Towards Improvement of Climate-Smart Traits and Disease Resistance Against Pathogens in Sweet Cherry. In Genomic Designing of Climate-Smart Fruit Crops (pp. 385-404). Springer, Cham.

Επιστημονικός υπεύθυνος (ΕΥ): Αλίκη Ξανθοπούλου

Μέλη Ερευνητικής Ομάδας:

ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΕΝΔΡΟΚΟΜΙΑΣ, ΑΠΘ

Δρ. Αθανάσιος Μολασιώτης, Καθηγητής, ΑΠΘ

Δρ. Μαρία Μανιουδάκη, Μεταδιδακτορική Ερευνήτρια, ΑΠΘ

Δρ. Θεόδωρος Μωυσιάδης, Μεταδιδακτορικός Ερευνητής, ΑΠΘ

Δρ. Μιχαήλ Μιχαϊλίδης, Μεταδιδακτορικός Ερευνητής, ΑΠΘ

Δρ. Ευάγγελος Καραγιάννης, Μεταδιδακτορικός Ερευνητής, ΑΠΘ

Ειρήνη Μπόσμαλη, Υποψήφια Διδάκτορας, ΑΠΘ

Δημήτριος Βαλασιάδης, Υποψήφιος Διδάκτορας, ΑΠΘ

ΣΥΝΕΡΓΑΖΟΜΕΝΟΙ ΕΡΕΥΝΗΤΕΣ/ΚΑΘΗΓΗΤΕΣ

Δρ. Ιωάννης Γανόπουλος, Κύριος Ερευνητής, Ινστιτούτο Γενετικής Βελτίωσης και Φυτογενετικών Πόρων-ΕΛΓΟ ΔΗΜΗΤΡΑ

Δρ. Ειρήνη Σάρρου, Εντεταλμένη Ερευνήτρια, Ινστιτούτο Γενετικής Βελτίωσης και Φυτογενετικών Πόρων-ΕΛΓΟ ΔΗΜΗΤΡΑ

Δρ. Γεωργία Τάνου, Εντεταλμένη Ερευνήτρια, Ινστιτούτο Εδαφοϋδατικών Πόρων-ΕΛΓΟ ΔΗΜΗΤΡΑ

Δρ. Ευαγγελία Αβραμίδου, Εντεταλμένη Ερευνήτρια, Ινστιτούτο Μεσογειακών και Δασικών Οικοσυστημάτων-ΕΛΓΟ ΔΗΜΗΤΡΑ

Δρ. Φίλιππος Αραβανόπουλος, Καθηγητής, Τμήμα Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος, ΑΠΘ

Δρ. Ειρήνη Νιάνιου-Ομπεϊντάτ, Αν. Καθηγήτρια, Τμήμα Γεωπονίας, ΑΠΘ

Δρ. Παναγιώτης Μαδέσης, Ερευνητής, Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών-ΕΚΕΤΑ

Dr. Stefan Martens, Ερευνητής, Fondazione Edmund Mach-Istituto Agrario San Michele Alladige

Dr. Sotirios Tsaftaris, Καθηγητής, Institute of Digital Communications School of Engineering University of Edinburgh